發(fā)布時(shí)間：2023-03-06 16:02:59
序言：寫(xiě)作是分享個(gè)人見(jiàn)解和探索未知領(lǐng)域的橋梁，我們?yōu)槟x了8篇的學(xué)習(xí)周計(jì)劃樣本，期待這些樣本能夠?yàn)槟峁┴S富的參考和啟發(fā)，請(qǐng)盡情閱讀。
關(guān)鍵詞：校園安全；監(jiān)控系統(tǒng)；平安校園
中圖分類(lèi)號(hào)：TP277 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1007-9599 (2011) 14-0000-01
Campus Security System Planning of the College of Science&Technology of Guizhou University
Jiang Ping
(College of Science and Technology of Guizhou University，Information Management and Experimental Center,Guiyang550004,China)
Abstract:Campus safety has become an issue of concern,the college began to focus on building security systems,this paper,the school building security control system described in detail to illustrate the attention to the problem,finally made a security system as a whole school of construction management of the construction of important technologies.
Keywords:Campus safety;Monitoring system;Safe campus
近年來(lái)，校園安全已成為一個(gè)大家普遍關(guān)注的問(wèn)題，在容納上千人甚至上萬(wàn)人的學(xué)校里，這樣的問(wèn)題更是突出。為提高高校在綜合安全管理上的效能，給高校的安全運(yùn)行提供技術(shù)保證，國(guó)家教育部提出了建立"平安校園"的綜合管理平臺(tái)，確保構(gòu)建一個(gè)和諧平安的綜合校園。貴州大學(xué)科技學(xué)院也積極的投入到“平安校園”的建設(shè)平臺(tái)中來(lái)。
科技學(xué)院占地面積18萬(wàn)平方米，校舍建筑面積8萬(wàn)平方米，學(xué)生宿舍3.15萬(wàn)平方米，擁有在校師生近萬(wàn)人。針對(duì)于學(xué)員情況決定采用安防監(jiān)控系統(tǒng)進(jìn)行安全防范。安防監(jiān)控系統(tǒng)主要對(duì)重點(diǎn)部位和重點(diǎn)區(qū)域進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控，在學(xué)校的主要地點(diǎn)進(jìn)行布控，包括學(xué)校的大門(mén)口、至宿舍樓的主要路段、宿舍樓、教學(xué)樓等地方，并通過(guò)硬盤(pán)錄像機(jī)實(shí)時(shí)記錄現(xiàn)場(chǎng)情況，由專(zhuān)人進(jìn)行24小時(shí)值班監(jiān)控，同時(shí)保持全天不間斷連續(xù)錄像并保存錄像資料30天。
安防監(jiān)控系統(tǒng)是應(yīng)用光纖、同軸電纜或微波在其閉合的環(huán)路內(nèi)傳輸視頻信號(hào)，并從攝像到圖像顯示和記錄構(gòu)成獨(dú)立完整的系統(tǒng)。它能實(shí)時(shí)、形象、真實(shí)地反映被監(jiān)控對(duì)象，不但極大地延長(zhǎng)了人眼的觀察距離，而且擴(kuò)大了人眼的機(jī)能，它可以在惡劣的環(huán)境下代替人工進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間監(jiān)視，讓人能夠看到被監(jiān)視現(xiàn)場(chǎng)的實(shí)際發(fā)生的一切情況，并通過(guò)錄像機(jī)記錄下來(lái)。而閉路電視監(jiān)控系統(tǒng)是安全防范領(lǐng)域中的重要組成部分，系統(tǒng)通過(guò)遙控前端攝像機(jī)及鏡頭、云臺(tái)等輔助設(shè)備，可以直接觀察被監(jiān)視場(chǎng)所的情況，同時(shí)可以把被監(jiān)視場(chǎng)所的情況進(jìn)行同步錄像。另外，電視監(jiān)控系統(tǒng)還可以與監(jiān)聽(tīng)、防盜報(bào)警系統(tǒng)等其他安全技術(shù)防范體系聯(lián)運(yùn)運(yùn)行。
電視監(jiān)控系統(tǒng)由前端攝像機(jī)部分、傳輸部分、控制部分及顯示和存儲(chǔ)部分四大塊組成。其中，監(jiān)控系統(tǒng)前端信號(hào)包括視頻、音頻、報(bào)警等多種輸入，前端可能是報(bào)警器、攝像頭、視頻編碼器、攝像機(jī)等；控制信息、巡查信息、報(bào)警信息和視頻信息等，按照工作流程在網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)各級(jí)傳輸；通過(guò)有線(xiàn)或無(wú)線(xiàn)等傳輸媒介，經(jīng)編碼解碼、調(diào)制解調(diào)、光/電或數(shù)/模轉(zhuǎn)換等方式，將前端設(shè)備的圖像及報(bào)警信號(hào)傳輸至控制設(shè)備。系統(tǒng)中前端監(jiān)控設(shè)備及各級(jí)監(jiān)控中心，均可對(duì)巡檢、報(bào)警、視音頻、系統(tǒng)日志等信息予以存儲(chǔ)。存儲(chǔ)和備份的報(bào)警、巡檢等歷史數(shù)據(jù)信息，可在網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)中依據(jù)授權(quán)進(jìn)行訪(fǎng)問(wèn)。系統(tǒng)應(yīng)能存儲(chǔ)下列信息并保持一定時(shí)間，可配置專(zhuān)用存儲(chǔ)設(shè)備備份需要長(zhǎng)期保存的信息。并且當(dāng)監(jiān)控點(diǎn)存在報(bào)警設(shè)備時(shí)系統(tǒng)應(yīng)具有與報(bào)警設(shè)備聯(lián)動(dòng)的接口，報(bào)警發(fā)生時(shí)能切換出相應(yīng)部位的視音頻及報(bào)警信息，并進(jìn)行記錄；對(duì)某些特定監(jiān)控點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)視頻移動(dòng)偵測(cè)功能；系統(tǒng)支持與其它業(yè)務(wù)系統(tǒng)進(jìn)行報(bào)警聯(lián)動(dòng)接口。
貴大科技學(xué)院校園安防監(jiān)控系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋱D如下：
貴大科技學(xué)院校園安防系統(tǒng)前端設(shè)計(jì)44個(gè)監(jiān)控點(diǎn)，所有攝像機(jī)通過(guò)視頻線(xiàn)分別接入三臺(tái)視頻分配器。所有接入視頻分配器的視頻信號(hào)一分為二，分別接入硬盤(pán)錄像機(jī)和視頻矩陣。矩陣主機(jī)輸出的6路信號(hào)接入電視墻的監(jiān)控器，通過(guò)控制鍵盤(pán)切換任意一路視頻信號(hào)在任意監(jiān)控器中顯示。接入硬盤(pán)錄像機(jī)的所有視頻信號(hào)通過(guò)硬盤(pán)錄像機(jī)進(jìn)行存儲(chǔ)錄像，錄像時(shí)間不少于25天。同時(shí)，所有硬盤(pán)錄像機(jī)和控制電腦接入交換機(jī)，控制電腦可以通過(guò)軟件對(duì)硬盤(pán)錄像機(jī)進(jìn)行集中管理。
關(guān)鍵詞：項(xiàng)目生命周期；化工單元仿真實(shí)訓(xùn)；探析
一、項(xiàng)目生命周期
項(xiàng)目生命周期（Project Life Cycle）是“總體上連續(xù)的各個(gè)項(xiàng)目階段的全體，項(xiàng)目階段數(shù)量和名稱(chēng)由參加項(xiàng)目機(jī)構(gòu)的控制需要所決定”。項(xiàng)目生命期最典型的形式包括四個(gè)項(xiàng)目生命期階段：?jiǎn)?dòng)階段（概念階段Conceive phase）、計(jì)劃階段（開(kāi)發(fā)階段Develop phase）、實(shí)施階段（執(zhí)行階段Execute phase）和收尾階段（結(jié)束階段Finish phase）。項(xiàng)目生命周期的每一階段都包含一個(gè)或幾個(gè)“啟動(dòng)―計(jì)劃―執(zhí)行―收尾”的循環(huán)。項(xiàng)目管理是通過(guò)諸如啟動(dòng)、規(guī)劃、實(shí)施、控制與收尾等過(guò)程進(jìn)行的。項(xiàng)目管理的過(guò)程反映了PDCA（Plan、Do、Control、Action）的原則，即事先計(jì)劃、事后控制。
在化工單元仿真實(shí)訓(xùn)中，仿真實(shí)訓(xùn)項(xiàng)目一旦確定，便具有一般項(xiàng)目的特征，所不同的是，一般項(xiàng)目追求的是項(xiàng)目的成果（或完成項(xiàng)目產(chǎn)品），而教學(xué)意義上的項(xiàng)目則將對(duì)項(xiàng)目成果的追求作為學(xué)生學(xué)習(xí)活動(dòng)的主線(xiàn)和驅(qū)動(dòng)力，真正追求的是學(xué)生在獲得項(xiàng)目成果進(jìn)程中的學(xué)習(xí)和經(jīng)驗(yàn)的增長(zhǎng)，在化工單元仿真實(shí)訓(xùn)教學(xué)中，追求的是學(xué)生在獲得項(xiàng)目成果進(jìn)程中對(duì)集散控制系統(tǒng)（DCS）操作技能的提高。
二、基于項(xiàng)目生命周期的化工單元仿真實(shí)訓(xùn)教學(xué)的過(guò)程
基于項(xiàng)目生命周期理論構(gòu)建化工單元仿真教學(xué)模式，將化工單元仿真教學(xué)過(guò)程分為項(xiàng)目的啟動(dòng)、計(jì)劃、執(zhí)行和收尾四個(gè)階段，如下表所示。
基于項(xiàng)目生命周期的化工單元仿真實(shí)訓(xùn)教學(xué)過(guò)程
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1.啟動(dòng)。這一階段由老師和學(xué)生共同完成，首先由老師對(duì)化工單元實(shí)訓(xùn)項(xiàng)目需要培訓(xùn)的技能目標(biāo)進(jìn)行描述，并把這個(gè)實(shí)訓(xùn)項(xiàng)目作為一項(xiàng)任務(wù)布置給學(xué)生，學(xué)生接到任務(wù)后，查閱資料，對(duì)化工單元仿真實(shí)訓(xùn)項(xiàng)目的原理、流程圖、操作步驟進(jìn)行熟悉和掌握。
2.計(jì)劃。按照項(xiàng)目生命周期理論，項(xiàng)目進(jìn)行可行性分析后就進(jìn)入到計(jì)劃階段。老師根據(jù)化工單元仿真實(shí)訓(xùn)項(xiàng)目及學(xué)生的學(xué)情制訂時(shí)間表，學(xué)生在此計(jì)劃的指導(dǎo)下掌握安全操作規(guī)范并制訂記錄表。
3.執(zhí)行。完成項(xiàng)目計(jì)劃后，進(jìn)入到計(jì)劃的執(zhí)行階段。學(xué)生根據(jù)制訂的計(jì)劃表，按計(jì)劃實(shí)施。這時(shí)老師承擔(dān)的是指導(dǎo)者、觀察員。將化工單元仿真實(shí)訓(xùn)項(xiàng)目實(shí)訓(xùn)過(guò)程分為學(xué)生自主練習(xí)、問(wèn)題討論、考核三個(gè)階段。學(xué)生通過(guò)第一階段的自主練習(xí)，將自主練習(xí)中遇到的問(wèn)題記錄下來(lái)進(jìn)行討論及操作經(jīng)驗(yàn)的交流，從而達(dá)到經(jīng)驗(yàn)總結(jié)的目的?？偨Y(jié)前一階段的經(jīng)驗(yàn)和教訓(xùn)后進(jìn)入考核環(huán)節(jié)，考核完成后輸出仿真系統(tǒng)成績(jī)考核評(píng)價(jià)表。
4.收尾。根據(jù)執(zhí)行過(guò)程中遇到的問(wèn)題及成績(jī)考核評(píng)價(jià)表學(xué)生進(jìn)行自評(píng)、互評(píng)及老師評(píng)價(jià)。學(xué)生首先對(duì)自己的操作過(guò)程進(jìn)行自我評(píng)價(jià)并進(jìn)行總結(jié)，然后學(xué)生在對(duì)操作過(guò)程進(jìn)行評(píng)價(jià)，查找操作過(guò)程中存在的問(wèn)題并介紹自己對(duì)這類(lèi)問(wèn)題的處理辦法。最后由老師對(duì)全組學(xué)生的實(shí)訓(xùn)操作進(jìn)行總結(jié)和評(píng)價(jià)，對(duì)容易出現(xiàn)操作問(wèn)題的環(huán)節(jié)和處理辦法重點(diǎn)講解，并對(duì)學(xué)生的操作進(jìn)行點(diǎn)評(píng)。同時(shí)將考核成績(jī)記錄歸檔作為平時(shí)成績(jī)的考核依據(jù)。
基于項(xiàng)目生命周期理論構(gòu)建化工單元仿真教學(xué)模式，將化工單元仿真實(shí)訓(xùn)教學(xué)過(guò)程分為啟動(dòng)、計(jì)劃、執(zhí)行、收尾四個(gè)階段，并將項(xiàng)目管理方法貫穿于整個(gè)仿真實(shí)訓(xùn)教學(xué)過(guò)程，使學(xué)生成為教學(xué)的主角，自主練習(xí)，自由探究，從而有利于對(duì)DCS操作技能的訓(xùn)練和掌握。
參考文獻(xiàn)：
[1]戚安邦，張連營(yíng).項(xiàng)目管理概論[M].清華大學(xué)出版社，2008.
[2]王敏.基于項(xiàng)目生命周期理論的人事檔案管理信息系統(tǒng)的構(gòu)建：以A校為例[M].江蘇大學(xué)，2010.
1、原始憑證：是指直接記錄經(jīng)濟(jì)業(yè)務(wù)、明確經(jīng)濟(jì)責(zé)任具有法律效力并作為記賬原始依據(jù)的證明文件，其主要作用是證明經(jīng)濟(jì)業(yè)務(wù)的發(fā)生和完成的情況。填寫(xiě)原始憑證的內(nèi)容為：原始憑證的名稱(chēng)、填制憑證的日期、編號(hào)、經(jīng)濟(jì)業(yè)務(wù)的基本內(nèi)容（對(duì)經(jīng)濟(jì)業(yè)務(wù)的基本內(nèi)容應(yīng)從定性和定量?jī)蓚€(gè)方面給予說(shuō)明，如購(gòu)買(mǎi)商品的名稱(chēng)、數(shù)量、單價(jià)和金額等），填制單位及有關(guān)人員的簽章。
2、記帳憑證：記帳憑證是登記帳薄的直接依據(jù)，在實(shí)行計(jì)算機(jī)處理帳務(wù)后，電子帳薄的準(zhǔn)確和完整性完全依賴(lài)于記帳憑證，操作中根據(jù)無(wú)誤的原始憑證填制記帳憑證。填制記帳憑證的內(nèi)容：憑證類(lèi)別、憑證編號(hào)、制單日期、科目?jī)?nèi)容等。
二、根據(jù)會(huì)計(jì)憑證登記日記帳。
日記帳一般分為現(xiàn)金日記帳和銀行存款日記帳；他們都由憑證文件生成的。計(jì)算機(jī)帳務(wù)處理中，日記帳由計(jì)算機(jī)自動(dòng)登記，日記帳的主要作用是用于輸出現(xiàn)金與銀行存款日記帳供出納員核對(duì)現(xiàn)金收支和結(jié)存使用。要輸出現(xiàn)金日記帳和銀行存款日記帳，要求系統(tǒng)初始化時(shí)，現(xiàn)金會(huì)計(jì)科目和銀行存款會(huì)計(jì)科目必須選擇“日記帳”標(biāo)記，即表明該科目要登記日記帳。
三、根據(jù)記賬憑證及所附的原始憑證登記明細(xì)帳。
明細(xì)分類(lèi)帳薄亦稱(chēng)明細(xì)帳，它是根據(jù)明細(xì)分類(lèi)帳戶(hù)開(kāi)設(shè)帳頁(yè)進(jìn)行明細(xì)分類(lèi)登記的一種帳薄，輸入記帳憑證后操作計(jì)算機(jī)則自動(dòng)登記明細(xì)帳。
四、根據(jù)記賬憑證及明細(xì)帳計(jì)算產(chǎn)品成本。根據(jù)記帳憑證及明細(xì)帳用逐步結(jié)算法中的綜合結(jié)轉(zhuǎn)法計(jì)算出產(chǎn)品的成本。
五、根據(jù)記賬憑證編科目匯總表。
科目匯總表也由憑證文件生成，其編制方法為對(duì)用戶(hù)輸入需匯總的起止日期則計(jì)算機(jī)自動(dòng)生成相應(yīng)時(shí)間段的科目匯總表。
六、根據(jù)科目匯總表登記總帳。
根據(jù)得出的科目匯總表操作計(jì)算機(jī)，計(jì)算機(jī)產(chǎn)生出對(duì)應(yīng)的總帳。
七、對(duì)帳（編試算平衡表）。
對(duì)帳是對(duì)帳薄數(shù)據(jù)進(jìn)行核對(duì)，以檢查記帳是否正確，以及帳薄是否平衡。它主要是通過(guò)核對(duì)總帳與明細(xì)帳、總帳與輔助帳數(shù)據(jù)來(lái)完成帳帳核對(duì)。試算平衡表就是將系統(tǒng)中設(shè)置的所有科目的期末余額按會(huì)計(jì)平衡公式借方余額=貸方余額進(jìn)行平衡檢驗(yàn)，并輸出科目余額表及是否平衡信息。一般來(lái)說(shuō)計(jì)算機(jī)記帳后，只要記帳憑證錄入正確，計(jì)算機(jī)自動(dòng)記帳后各種帳薄應(yīng)該是正確的、平衡的，但由于非法操作，計(jì)算機(jī)病毒或其他原因有可能回造成某些數(shù)據(jù)被破壞，因此引起帳帳不符，為保證帳證相符，應(yīng)經(jīng)常進(jìn)行對(duì)帳，每月至少一次，一般在月末結(jié)帳前進(jìn)行。
八、根據(jù)給出的相關(guān)內(nèi)容編制本月的負(fù)債表和損益表；
將十二
月月初數(shù)視為年初數(shù)，本月視為本年數(shù)編制會(huì)計(jì)報(bào)表。
資產(chǎn)負(fù)債表是反映企業(yè)在某一特定日期財(cái)務(wù)狀況的一種會(huì)計(jì)報(bào)表，它根據(jù)“資產(chǎn)=負(fù)債+所有者權(quán)益”的會(huì)計(jì)方程式，說(shuō)明企業(yè)的財(cái)務(wù)狀況。
損益表是反映企業(yè)在一定期間內(nèi)的經(jīng)營(yíng)成果的會(huì)計(jì)報(bào)表，損益表按照權(quán)責(zé)發(fā)生制原則和配比原則把一個(gè)會(huì)計(jì)期間的收入與成本、費(fèi)用進(jìn)行配比，從而計(jì)算出報(bào)告期的凈損益數(shù)。根據(jù)具體要求操作計(jì)算機(jī)得出本月的負(fù)債表和損益表。
通過(guò)此次實(shí)習(xí)，不僅培養(yǎng)了我的實(shí)際動(dòng)手能力，增加了實(shí)際的操作經(jīng)驗(yàn)，縮短了抽象的課本知識(shí)與實(shí)際工作的距離，對(duì)實(shí)際的財(cái)務(wù)工作的有了一個(gè)新的開(kāi)始；同時(shí)也讓我認(rèn)識(shí)到了傳統(tǒng)手工會(huì)計(jì)和會(huì)計(jì)電算化的有共同之處和不同之處；
一、共同點(diǎn)為：
1、無(wú)論是傳統(tǒng)手工會(huì)計(jì)和電算化會(huì)計(jì)其最終目標(biāo)仍是為了加強(qiáng)經(jīng)營(yíng)管理，提供會(huì)計(jì)信息，參與經(jīng)濟(jì)決策，提高經(jīng)濟(jì)效益。
2、傳統(tǒng)手工會(huì)計(jì)和電算化會(huì)計(jì)都是遵守會(huì)計(jì)法規(guī)，會(huì)計(jì)法規(guī)是會(huì)計(jì)工作的重要依據(jù)。
3、傳統(tǒng)手工會(huì)計(jì)和電算化會(huì)計(jì)都遵循基本的會(huì)計(jì)理論與會(huì)計(jì)方法及會(huì)計(jì)準(zhǔn)則。
4、傳統(tǒng)手工會(huì)計(jì)和電算化會(huì)計(jì)基本功能相同，基本功能為：信息的采集與記錄、信息的存儲(chǔ)、信息的加工處理、信息的傳輸、信息的輸出。
5、保存會(huì)計(jì)檔案。
6、編制會(huì)計(jì)報(bào)表。
二、不同點(diǎn)為：
1、運(yùn)算工具不同傳統(tǒng)手工會(huì)計(jì)運(yùn)算工具是算盤(pán)或電子計(jì)算器等，計(jì)算過(guò)程每運(yùn)算一次要重復(fù)一次，由于不能存儲(chǔ)運(yùn)算結(jié)果，人要邊算邊記錄，工作量大，速度慢。電算化會(huì)計(jì)的運(yùn)算工具是電子計(jì)算機(jī)，數(shù)據(jù)處理由計(jì)算機(jī)完成，能自動(dòng)及時(shí)的存儲(chǔ)運(yùn)算結(jié)果，人只要輸入原始數(shù)據(jù)便能得到所希望的信息。
2、信息載體不同；傳統(tǒng)手工會(huì)計(jì)所有信息都以紙張為載體，占用空間大，不易保管，查找困難。電算化會(huì)計(jì)除了必要的會(huì)計(jì)憑證之外，均可用磁盤(pán)、磁帶做信息載體，它占用空間小，保管容易，查找方便。
3、帳薄規(guī)則不同；傳統(tǒng)手工會(huì)計(jì)規(guī)定日記帳、總帳要用訂本式帳冊(cè)，明細(xì)帳要用活頁(yè)式帳冊(cè)；帳薄記錄的錯(cuò)誤要用化線(xiàn)法和紅字法更正；帳頁(yè)中的空行、空頁(yè)要用紅線(xiàn)劃消。電算化會(huì)計(jì)不采用傳統(tǒng)手工會(huì)計(jì)中的一套改錯(cuò)方案，凡是登記過(guò)帳的數(shù)據(jù)，不得更改（當(dāng)然還是要輔以技術(shù)控制），即使有錯(cuò)，只能采用輸入“更改憑證”加以改正，以留下改動(dòng)痕跡。對(duì)需要打印的帳頁(yè)的空行、空頁(yè)可以用手工處理。
4、帳務(wù)的處理程序（會(huì)計(jì)核算形式）不同傳統(tǒng)手工會(huì)計(jì)處理帳務(wù)的程序有4種，但都避免不了重復(fù)轉(zhuǎn)抄與計(jì)算的根本弱點(diǎn)，伴之而來(lái)的是人員與環(huán)節(jié)的增多和差錯(cuò)的增多。成熟的電算化會(huì)計(jì)的帳務(wù)處理程序用同一模式來(lái)處理不同企業(yè)的會(huì)計(jì)業(yè)務(wù)，成本核算程序以軟件固化形式在計(jì)算機(jī)里，從會(huì)計(jì)憑證到會(huì)計(jì)報(bào)表的過(guò)程都由計(jì)算機(jī)處理完成后，而任何要求的輸出都能得到滿(mǎn)足。
5、會(huì)計(jì)工作組織體制不同；傳統(tǒng)手工會(huì)計(jì)的會(huì)計(jì)組織工作以會(huì)計(jì)事物的不同性質(zhì)作為制定的主要依據(jù)；電算化會(huì)計(jì)組織體制以數(shù)據(jù)的不同形態(tài)做為制定的主要依據(jù)。
6、人員結(jié)果不同；傳統(tǒng)手工會(huì)計(jì)中的人員均是會(huì)計(jì)專(zhuān)業(yè)人員，其中的權(quán)威應(yīng)是會(huì)計(jì)師；電算化會(huì)計(jì)中的人員由會(huì)計(jì)專(zhuān)業(yè)人員、電子計(jì)算機(jī)軟件、硬件及操作人員組成，其中權(quán)威應(yīng)為掌握電算化會(huì)計(jì)中級(jí)的會(huì)計(jì)師。
7、內(nèi)部控制不同；傳統(tǒng)手工會(huì)計(jì)對(duì)會(huì)計(jì)憑證的正確性，一般從摘要內(nèi)容、數(shù)量、單價(jià)、金額、會(huì)計(jì)科目等項(xiàng)目來(lái)審核；對(duì)帳戶(hù)的正確性一般從三套帳的相互核對(duì)來(lái)驗(yàn)證；還通過(guò)帳證相符、帳帳相符、帳實(shí)相符等內(nèi)部控制方式來(lái)保證數(shù)據(jù)的正確，堵塞漏洞。電算化會(huì)計(jì)由于帳務(wù)處理程序和會(huì)計(jì)工作組體制的變化，除原始數(shù)據(jù)的收集、審核、編碼由原會(huì)計(jì)人員進(jìn)行外，其余的處理都由計(jì)算機(jī)部門(mén)負(fù)責(zé)。內(nèi)部控制方式部分被計(jì)算機(jī)技術(shù)替代，由手工控制轉(zhuǎn)為人機(jī)控制。
以上種種區(qū)別，集于一點(diǎn)，就是由于電算化會(huì)計(jì)數(shù)據(jù)處理方式的改變，引起了傳統(tǒng)手工會(huì)計(jì)各個(gè)方面的變化，這一變化將使得系統(tǒng)功能更為加強(qiáng)，系統(tǒng)結(jié)構(gòu)更為合理，系統(tǒng)管理更為完善。
會(huì)計(jì)電算化是會(huì)計(jì)史上嶄新的一頁(yè)。電子計(jì)算機(jī)的應(yīng)用，首先帶來(lái)數(shù)據(jù)處理工具的改變，也帶來(lái)了信息載體的變化，電算化會(huì)計(jì)后對(duì)傳統(tǒng)會(huì)計(jì)方法、會(huì)計(jì)理論都將發(fā)生巨大的影響，從而引起會(huì)計(jì)制度、會(huì)計(jì)工作管理體制的變革。會(huì)計(jì)電算化促進(jìn)著會(huì)計(jì)的規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化，通用化促進(jìn)著管理的現(xiàn)代化。
關(guān)鍵詞：牛；顆粒細(xì)胞；血清饑餓；同步化；細(xì)胞周期
中圖分類(lèi)號(hào)：Q813；S823．3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：0439－8114（2012）08－1632-04
自1997年克隆綿羊Dolly誕生以來(lái)，體細(xì)胞克隆技術(shù)得到了飛速的發(fā)展，已在許多動(dòng)物中獲得了成功［1－4］。在體細(xì)胞克隆研究中，供體細(xì)胞的選擇和制備是提高體細(xì)胞克隆效率的關(guān)鍵步驟［5，6］。研究者從供體細(xì)胞的類(lèi)型、供體來(lái)源、培養(yǎng)時(shí)間、核質(zhì)同步化處理方法、培養(yǎng)液組成等方面進(jìn)行了大量研究，以期獲得最好的供體細(xì)胞來(lái)提高體細(xì)胞克隆的效率。在體細(xì)胞克隆過(guò)程中，供體細(xì)胞和受體細(xì)胞核質(zhì)同步化是影響克隆效率的一個(gè)關(guān)鍵因素。處于G0／G1期的供體細(xì)胞通常被認(rèn)為是理想的進(jìn)行克隆研究的供體細(xì)胞，血清饑餓是誘導(dǎo)供體細(xì)胞進(jìn)入G0／G1期階段的主要方法［7－9］。雖然人們嘗試使用不同的血清濃度和不同的血清饑餓時(shí)間來(lái)誘導(dǎo)供體細(xì)胞進(jìn)入G0／G1期，也取得了不錯(cuò)的試驗(yàn)結(jié)果［10，11］，但很少將血清饑餓濃度、饑餓時(shí)間及細(xì)胞傳代階段與細(xì)胞周期的同步化做深入的關(guān)聯(lián)分析研究。該試驗(yàn)研究了牛卵巢顆粒細(xì)胞制備過(guò)程中不同的血清濃度、血清饑餓時(shí)間以及體外培養(yǎng)時(shí)間對(duì)細(xì)胞周期同步化的影響。
1材料與方法
1．1材料
黃牛卵巢采自貴陽(yáng)市某屠宰場(chǎng)；胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；DPBS、胰蛋白酶、DMEM、青霉素、鏈霉素、DMSO和透明質(zhì)酸購(gòu)自Hyclone公司；RNaseA、碘化丙啶（PI）和TritonX-100購(gòu)自南京凱基生物工程有限公司。
1．2牛卵巢顆粒細(xì)胞制備
黃牛卵巢從屠宰場(chǎng)收集后裝入加有100 IU/mL 鏈霉素和100 IU／mL青霉素的30℃ 的DPBS中，于4 h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。將卵巢帶回實(shí)驗(yàn)室后以DPBS清洗2次，從卵巢表面抽取卵泡液，取2 mL卵泡液用等量的0．2％透明質(zhì)酸酶消化3 min，用DMEM離心洗滌（1 500 r／min，6 min）2次，然后用DMEM調(diào)整顆粒細(xì)胞的密度為1×106個(gè)／mL，將顆粒細(xì)胞移入加體積分?jǐn)?shù)10％FCS、2 mmol／L谷氨酰胺、100 IU／mL青霉素和鏈霉素的DMEM中進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)至80％～90％時(shí)進(jìn)行細(xì)胞消化傳代培養(yǎng)。細(xì)胞消化用含0．1％胰蛋白酶和0．02％EDTA的消化液，在37．5℃下進(jìn)行。細(xì)胞冷凍保存液是含有20％（V／V） FCS和5％ DMSO的DMEM。顆粒細(xì)胞培養(yǎng)至第2、10和25代，在0．5％和0．05％ FCS濃度下分別處理2、3、4和5 d以誘導(dǎo)顆粒細(xì)胞進(jìn)入G0／G1期。
1．3PI染色法檢測(cè)細(xì)胞周期
培養(yǎng)的牛卵巢顆粒細(xì)胞在37．5 ℃下用0．1％胰蛋白酶和0．02％ EDTA的消化液消化處理，然后移入5 mL離心管中用 DPBS離心洗滌（1 500 r／min，6 min）2次，再用DPBS調(diào)整細(xì)胞濃度，使每個(gè)離心管中細(xì)胞的數(shù)目達(dá)到1×105個(gè)。細(xì)胞在4 ℃ 條件下加入3 mL預(yù)冷的 70％ 乙醇進(jìn)行固定，過(guò)夜。固定后的細(xì)胞用提前預(yù)冷的DPBS洗滌離心2次，然后在每管中加入含有1 mg／mL RNase A 的0．5 mL PBS，在37 ℃的水浴中處理30 min。細(xì)胞染色是在4 ℃ 條件下以0．1 mg／mL PI 和0．1％ TritonX－100避光處理2 h。染色處理結(jié)束的細(xì)胞用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其細(xì)胞周期。
1．4試驗(yàn)方法
1．4．1培養(yǎng)時(shí)間對(duì)體外培養(yǎng)的牛卵巢顆粒細(xì)胞G0／G1期的影響探討牛卵巢顆粒細(xì)胞體外培養(yǎng)時(shí)間對(duì)其細(xì)胞周期的影響，分別將培養(yǎng)至第2、10和25代的牛卵巢顆粒細(xì)胞用0．5％ FCS饑餓誘導(dǎo)處理2 d，然后用PI染色法處理細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同培養(yǎng)時(shí)間細(xì)胞的細(xì)胞周期。
1．4．2不同濃度的FCS對(duì)牛卵巢顆粒細(xì)胞G0／G1期的影響探討血清饑餓在對(duì)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的牛卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)入G0／G1期的影響，將體外培養(yǎng)至第5代的牛卵巢顆粒細(xì)胞分別用含0．5％ FCS和0．05％ FCS的培養(yǎng)液誘導(dǎo)處理2 d，對(duì)照組為10％ FCS。然后用PI染色法處理細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同試驗(yàn)處理細(xì)胞的細(xì)胞周期。
1．4．3血清饑餓時(shí)間對(duì)牛卵巢細(xì)胞G0／G1期的影響探討血清饑餓時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的牛卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)入G0／G1期的影響，將體外培養(yǎng)至第5代的牛卵巢顆粒細(xì)胞用含0．5％ FCS的培養(yǎng)液分別處理2、3、4和5 d，然后用PI染色法處理細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)不同處理細(xì)胞的細(xì)胞周期。
1．5統(tǒng)計(jì)分析
數(shù)據(jù)采用SPSS 11．5軟件分析，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。
2結(jié)果與分析
2．1培養(yǎng)時(shí)間對(duì)牛卵巢顆粒細(xì)胞G0／G1期的影響
將培養(yǎng)至第2、10和25代的牛卵巢顆粒細(xì)胞用0．5％ FCS饑餓誘導(dǎo)處理2 d，不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)其細(xì)胞周期的影響見(jiàn)表1。第2、10和25代牛卵巢顆粒細(xì)胞G0／G1期的百分比分別為82．6％、84．7％和83．8％，各組之間差異不顯著（P＞0．05）。
2．2不同濃度的FCS對(duì)牛卵巢顆粒細(xì)胞G0／G1期的影響
將體外培養(yǎng)至第5代的牛卵巢顆粒細(xì)胞用加有0．5％ FCS 和0．05％ FCS 的培養(yǎng)液誘導(dǎo)處理2 d，不同濃度的FCS對(duì)牛卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)入G0／G1期的影響見(jiàn)表2。由表2可知，0．5％ FCS和0．05％ FCS試驗(yàn)組較對(duì)照組顯著提高了G0／G1期細(xì)胞的百分比（P＜0．05），但試驗(yàn)組間差異不顯著（P＞0．05），兩者均獲得了比較高比例的G0／G1期細(xì)胞，但對(duì)照組（10％ FCS）僅有62．4％的細(xì)胞處于G0／G1期。
2．3血清饑餓時(shí)間對(duì)牛卵巢顆粒細(xì)胞G0／G1期的影響
將體外培養(yǎng)至第5代的牛卵巢顆粒細(xì)胞用加有0．5％ FCS的培養(yǎng)液分別處理2、3、4和5 d，饑餓時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的牛卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)入G0／G1期的影響見(jiàn)表3。從表3中可以看出，隨著饑餓處理時(shí)間的增加，G0／G1期細(xì)胞的百分比呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)。饑餓處理5 d較2 d顯著提高了G0／G1期細(xì)胞的百分比（P＜0．05），饑餓處理2 d和5 d后的G0／G1期細(xì)胞的百分比分別為81．2％和87．6％。
3小結(jié)與討論
體細(xì)胞克隆技術(shù)中供體細(xì)胞的細(xì)胞周期和受體細(xì)胞核質(zhì)同步化是影響克隆效率的一個(gè)關(guān)鍵因素。供體細(xì)胞處于G0／G1階段有益于供體細(xì)胞和受體細(xì)胞的核質(zhì)同步化以及重構(gòu)胚的再程序化，而且能夠正常的濃縮染色體，在第一次細(xì)胞分裂的末期維持正常的染色體倍數(shù)［12］。在長(zhǎng)期的研究中，人們采用了幾種不同的研究方法得到處于G0／G1階段的供體細(xì)胞［13，14］。在供體細(xì)胞的細(xì)胞周期同步化中，人們常以血清饑餓誘導(dǎo)供體細(xì)胞進(jìn)入G0／G1期。在牛成纖維細(xì)胞的研究中，通過(guò)0．05％濃度的血清誘導(dǎo)供體細(xì)胞取得了成功，同時(shí)通過(guò)延長(zhǎng)低濃度血清誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的時(shí)間，提高了G0／G1階段細(xì)胞的比例［15］。在當(dāng)前的研究中，0．5％和0．05％濃度的FCS在誘導(dǎo)牛卵巢顆粒細(xì)胞獲得高比例G0／G1期細(xì)胞方面沒(méi)有顯著差異，但0．5％和0．05％的FCS較10％的FCS顯著提高了牛卵巢顆粒細(xì)胞G0／G1期細(xì)胞的比例。這表明低濃度的血清誘導(dǎo)可以提高牛卵巢顆粒細(xì)胞G0／G1期的比例，但不同水平的低濃度血清對(duì)誘導(dǎo)牛卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)入G0／G1期沒(méi)有影響。結(jié)合以前的研究報(bào)道和本試驗(yàn)的結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)并非血清饑餓就可以誘導(dǎo)體細(xì)胞獲得高比例的G0／G1期，這中間除了有不同實(shí)驗(yàn)室工作環(huán)境和操作工藝存在差別的原因外，可能還與細(xì)胞類(lèi)型及細(xì)胞來(lái)源有關(guān)。本研究中，通過(guò)延長(zhǎng)0．5％濃度FCS對(duì)牛卵巢顆粒細(xì)胞的誘導(dǎo)時(shí)間，發(fā)現(xiàn)饑餓處理5 d的牛卵巢顆粒細(xì)胞較處理2 d的牛卵巢顆粒細(xì)胞均獲得了較高的G0／G1期細(xì)胞百分比。在對(duì)牛成纖維細(xì)胞的血清饑餓誘導(dǎo)研究中有和本試驗(yàn)的結(jié)果基本一致，研究人員將血清饑餓的時(shí)間延長(zhǎng)至14 d，得到了高比例的G0／G1期牛成纖維細(xì)胞［16］。以前的研究和我們的試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明通過(guò)延長(zhǎng)血清饑餓的時(shí)間同樣可以獲得高比例的G0／G1期供體細(xì)胞。
在體細(xì)胞克隆研究中，人們發(fā)現(xiàn)Dolly的端粒長(zhǎng)度明顯短于同齡羊，而與供體乳腺細(xì)胞的端粒長(zhǎng)度相當(dāng)。這就提出了一個(gè)問(wèn)題，體細(xì)胞克隆動(dòng)物是否會(huì)遺傳供體核縮短了的端粒給后代，從而導(dǎo)致過(guò)早衰老。但之后幾年大量的研究表明，端粒復(fù)原存在于大部分克隆動(dòng)物中，端?？s短可能不是造成克隆動(dòng)物高死亡率的最主要原因。但在供體細(xì)胞體外制備過(guò)程中，人們又在擔(dān)心體外長(zhǎng)期培養(yǎng)的細(xì)胞可能會(huì)給供體細(xì)胞本身和重構(gòu)胚體外培養(yǎng)帶來(lái)負(fù)面影響。而且有人認(rèn)為供體細(xì)胞衰老對(duì)重構(gòu)胚的發(fā)育潛能有影響，所以通常選擇體外培養(yǎng)短期階段的體細(xì)胞進(jìn)行克隆［17］。但大量的研究也表明，體外長(zhǎng)期培養(yǎng)的細(xì)胞在重構(gòu)胚構(gòu)建及重構(gòu)胚發(fā)育方面優(yōu)于短期培養(yǎng)的細(xì)胞［18］。在本試驗(yàn)中，培養(yǎng)至第2、10和25代的牛卵巢顆粒細(xì)胞均獲得了相近比例的G0／G1期細(xì)胞。這表明體外培養(yǎng)的牛卵巢顆粒細(xì)胞是否衰老對(duì)通過(guò)血清饑餓誘導(dǎo)細(xì)胞獲得G0／G1期細(xì)胞的比例沒(méi)有影響。因此，在牛卵巢顆粒細(xì)胞制備用作供體細(xì)胞的研究中，血清饑餓誘導(dǎo)可以提高細(xì)胞G0／G1期的比例，但不同水平的低濃度血清對(duì)誘導(dǎo)牛卵巢顆粒細(xì)胞進(jìn)入G0／G1期沒(méi)有影響，延長(zhǎng)饑餓誘導(dǎo)的時(shí)間可以提高G0／G1期細(xì)胞的比例；體外傳代時(shí)間對(duì)牛卵巢顆粒細(xì)胞G0／G1期細(xì)胞比例的影響不顯著。
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【關(guān)鍵詞】 血管緊張素Ⅱ; 動(dòng)脈粥樣硬化; 血管平滑肌細(xì)胞
【Abstract】 AngiotensinⅡ（AngII）has growth factor and cytokine-like properties . It plays an important role in the developement of atherosclerosis (AS). The effects of promoting migration， proliferation， apoptosis， phenotype translation and promoting the secretion and expression of many kinds of pro-inflammatory cytokines， growth factors and extracellular matrix proteins to vascular smooth muscle cells(VSMCs) in the progress of antherosclerosis are reviewed in this article.
【Key words】 angiotensinⅡ; atherosclerosis;vascular smooth muscle cell
動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是由一系列細(xì)胞及分子參與的炎癥反應(yīng)性疾病。血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）的活化、遷移與增殖是動(dòng)脈粥樣硬化病變發(fā)展的必要條件［1］。 血管平滑肌細(xì)胞是動(dòng)脈中膜的主要組成成分，在動(dòng)脈硬化早期，在眾多生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子作用下，其從血管中膜遷移至內(nèi)膜，進(jìn)而發(fā)生表型轉(zhuǎn)化并增殖，其自身也可合成多種細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子，還可攝取脂質(zhì)成為肌源性泡沫細(xì)胞。當(dāng)脂質(zhì)過(guò)分充滿(mǎn)細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞破裂，脂質(zhì)在細(xì)胞外側(cè)沉積，細(xì)胞本身死亡，而成為斑塊中的纖維成分。其病理變化伴隨著動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展。最終使血管內(nèi)膜增厚，導(dǎo)致管腔狹窄。
血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）是腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAS）中主要的活性肽產(chǎn)物。近年來(lái)，大量的研究表明，Ang Ⅱ參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展［2］。Ang Ⅱ可引起血管收縮，導(dǎo)致高血壓，繼發(fā)性引起AS。另外，Ang Ⅱ通過(guò)若干細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞系統(tǒng)的活化，通過(guò)內(nèi)皮損害或炎癥狀態(tài)獨(dú)立于血壓促進(jìn)AS的發(fā)生。在AS的過(guò)程中，Ang Ⅱ有促進(jìn)VSMCs遷移、增殖和凋亡的作用，并可促進(jìn)其表達(dá)與分泌多種炎癥細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，進(jìn)而促進(jìn)斑塊形成。其在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著重要作用。
1 血管緊張素Ⅱ及其受體的生物學(xué)功能
自從1898年發(fā)現(xiàn)腎素后，RAS系統(tǒng)對(duì)心血管系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用已被認(rèn)識(shí)100多年。AngⅡ是RAS的主要活性成分，主要由循環(huán)或局部的血管緊張素原或血管緊張素Ⅰ（AngⅠ）在水解酶作用下水解產(chǎn)生。生成Ang Ⅱ的途徑有兩種：一種是血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme， ACE) 途徑；另一種是糜酶(chy2mase)依賴(lài)的旁路途徑。前者是生成Ang Ⅱ的經(jīng)典途徑，主要生成循環(huán)的Ang Ⅱ，而后者是局部Ang Ⅱ生成的主要途徑。AngⅡ不僅具有強(qiáng)烈的縮血管、升高動(dòng)脈血壓的作用，而且通過(guò)其受體在影響細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、凋亡和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng) 、組織纖維化、凝血機(jī)制等方面起著重要病理生理作用。有證據(jù)表明，粥樣硬化的動(dòng)脈ACE表達(dá)增加，局部AngⅡ的生成增多， AngⅡ通過(guò)增多氧化自由基，促進(jìn)黏附分子的表達(dá)，誘發(fā)炎癥過(guò)程，在AS的進(jìn)展中起重要作用［3］。另外在VSMCs、心肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及多種上皮來(lái)源細(xì)胞中， AngⅡ還具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。其促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制與血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF）、c-myc、胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulin like growth factor-1，IGF-1）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子等作用有關(guān)。
AngⅡ通過(guò)其受體發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，其受體可分為血管緊張素1型受體(AT1R)、血管緊張素2型受體（AT2R)、血管緊張素3型受體（AT3R)和血管緊張素4型受體（AT4R)四種亞型，目前了解較多的是AT1R型和AT2R型， AT1R又進(jìn)一步分為AT1aR 和AT1bR兩個(gè)亞型。AT1R主要分布在于血管、心、腦、腎、肝臟等組織器官中 ，而AT2R主要存在于胎兒組織、腎上腺髓質(zhì)、成人的腦組織，子宮、卵泡中也可見(jiàn)到。AT1R和AT2R均屬于G蛋白耦聯(lián)受體。研究表明， AT1R通過(guò)Gq激活磷脂酶C促進(jìn)1， 4， 5 - 三磷酸肌醇( IP3 )和二酰甘油產(chǎn)生及Ca2+代謝和蛋白激酶C的激活或通過(guò)酪氨酸蛋白激酶途徑激活絲裂原活化蛋白激酶等機(jī)制，完成AngⅡ收縮血管、促進(jìn)細(xì)胞增殖等功能。在成熟組織中，幾乎所有已知的AngⅡ作用都是通過(guò)AT1R所介導(dǎo)的。這些作用包括:血管平滑肌收縮、醛固酮的分泌、致渴反應(yīng)， 腎重吸收鈉， 升壓及心動(dòng)過(guò)速反應(yīng)。而AT2R通過(guò)與第三個(gè)胞內(nèi)環(huán)激活Gi和酪氨酸磷酸酶通路，滅活胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶而實(shí)現(xiàn)其抑制生長(zhǎng)的作用。AT2R主要表達(dá)于胎兒，因此其生物學(xué)活性主要表現(xiàn)為: （1）在胎兒腎中誘導(dǎo)細(xì)胞分化; （2）抑制細(xì)胞肥大、增殖，誘導(dǎo)凋亡。目前研究表明AT1R和AT2R在細(xì)胞增長(zhǎng)和增殖、血管張力、血管腎素的釋放等方面作用相反。但是，有關(guān)ATR的生物學(xué)特性的具體機(jī)制還不完全清楚，有待進(jìn)一步的研究。
2 血管緊張素Ⅱ?qū)?dòng)脈粥樣硬化中血管平滑肌細(xì)胞的作用
AS中，Ang Ⅱ可促進(jìn)VSMCs遷移、增殖及其表型轉(zhuǎn)化，并有促進(jìn)VSMCs各種炎性細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白表達(dá)與分泌的作用，致AS斑塊逐漸形成。
2．1 Ang Ⅱ?qū)SMCs表型轉(zhuǎn)化、遷移及增殖的作用 VSMCs可分為收縮型和合成型兩種表型。正常成人動(dòng)脈血管內(nèi)的平滑肌細(xì)胞以收縮型為主，主要功能是維持血管的彈性和收縮血管，而合成型分化程度低或處于未分化狀態(tài)，合成和分泌基質(zhì)蛋白能力強(qiáng)，主要功能是增殖、遷移入內(nèi)膜和合成基質(zhì)，主要位于胚胎中期血管或病理血管中［4］。Ang Ⅱ可促進(jìn)VSMCs由收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚?，并獲得遷移、增殖和合成、分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的能力，嚴(yán)重時(shí)引發(fā)血管重構(gòu)，促進(jìn)AS病變的發(fā)生與發(fā)展［5］。
景濤等［6］研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的大鼠VSMCs在基礎(chǔ)狀態(tài)下也存在AT1R的表達(dá)，給予Ang Ⅱ刺激后，在短時(shí)間內(nèi)迅速使VSMCs內(nèi)AT1R表達(dá)上調(diào)，刺激大鼠VSMCs發(fā)生跨膜遷移并使VSMCs內(nèi)肌動(dòng)蛋白組裝為整齊的應(yīng)力纖維網(wǎng)；而預(yù)先給予AT1R拮抗劑CV-11974處理后再給予Ang Ⅱ，結(jié)果使AT1R表達(dá)下調(diào)。AT1R拮抗劑CV-11974可明顯抑制VSMCs內(nèi)應(yīng)力纖維絲形成，并呈濃度依賴(lài)性抑制AngⅡ介導(dǎo)的VSMCs遷移；AT2R拮抗劑PD123319對(duì)VSMCs應(yīng)力纖維絲形成和VSMCs跨膜遷移細(xì)胞數(shù)均無(wú)顯著的影響，同時(shí)阻斷AT1R和AT2R后VSMCs的跨膜遷移細(xì)胞數(shù)及應(yīng)力纖維絲形成情況與單獨(dú)阻斷AT1R時(shí)差異無(wú)顯著性。提示不同濃度的Ang Ⅱ可能是通過(guò)AT1R介導(dǎo)來(lái)調(diào)節(jié)VSMCs內(nèi)肌動(dòng)蛋白組裝成應(yīng)力纖維網(wǎng)。從而發(fā)揮其介導(dǎo)VSMCs遷移的生物學(xué)效應(yīng)。而AT2R在生物學(xué)功能上并無(wú)與AT1R相拮抗的作用。Yasunari K等［7］通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)壓力升高可使Ang Ⅱ介導(dǎo)的冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞遷移增加。因而高血壓是AS的危險(xiǎn)因素之一。
Ang Ⅱ以一種有效的生長(zhǎng)因子促進(jìn)VSMCs增殖。其通過(guò)與G蛋白耦聯(lián)的AT1R作用，激活細(xì)胞內(nèi)的多種信號(hào)傳導(dǎo)路徑，達(dá)到促進(jìn)VSMCs增殖的目的。Q.N.Diep等［8］通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Ang Ⅱ引起的VSMCs增殖能被抑制劑氯沙坦抑制，而用AT2R抑制劑卻能引起更明顯的主動(dòng)脈VSMCs增殖。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明AT1R具有介導(dǎo)Ang Ⅱ促VSMCs增殖的作用，而AT2R并不具有此作用。實(shí)驗(yàn)中用AT2R抑制劑后使更多的Ang Ⅱ與AT1R結(jié)合，致使Ang Ⅱ的促增殖作用更顯著。
2．2 Ang Ⅱ?qū)SMCs炎性細(xì)胞因子表達(dá)與分泌的作用 對(duì)AS斑塊的免疫學(xué)研究發(fā)現(xiàn)， Ang Ⅱ可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞、斑塊內(nèi)的巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞 （SMC）、成纖維細(xì)胞等產(chǎn)生多種炎性細(xì)胞因子，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生與發(fā)展。對(duì)于VSMCs，Ang Ⅱ可通過(guò)其表面受體介導(dǎo)，進(jìn)而活化細(xì)胞內(nèi)若干信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，促進(jìn)單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP1）、IL-6、IL-18Rα等多種炎性細(xì)胞因子的表達(dá)，參與AS發(fā)生發(fā)展的多個(gè)階段。
在AS發(fā)生、發(fā)展的多個(gè)階段，促進(jìn)斑塊的不穩(wěn)定及破裂過(guò)程中，MCP1均起了重要作用。Chen等［9］證實(shí)AngⅡ可通過(guò) AT1R介導(dǎo)機(jī)制刺激培養(yǎng)的鼠大動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（RASMCs） 內(nèi) MCP1 的基因表達(dá)， 并且這種誘導(dǎo)依賴(lài)于對(duì)氧化還原反應(yīng)敏感信號(hào)轉(zhuǎn)遞事件，包括 NADH/NADPH氧化酶的激活、H2O2產(chǎn)生等，這種誘導(dǎo)同樣依賴(lài)于蛋白酪氨酸磷酸化和絲裂原活性蛋白激酶（MAPK）活性的級(jí)聯(lián)放大作用。Funakoshi 等［10］發(fā)現(xiàn) Rho 激酶也參與介導(dǎo)AngⅡ誘導(dǎo)的鼠平滑肌細(xì)胞對(duì)MCP1表達(dá)的過(guò)程。Binlin等［11］證實(shí)AngⅡ通過(guò)抑制核糖核酸酶活性增加VSMCs MCP1 mRNA穩(wěn)定性及其表達(dá)。
促炎細(xì)胞因子IL-6有誘導(dǎo)VSMCs遷移、增殖的作用，可加速AS炎癥反應(yīng)，并促進(jìn)斑塊向不穩(wěn)定的方向發(fā)展。Ang Ⅱ通過(guò)AT1R啟動(dòng)VSMCs內(nèi)信號(hào)傳遞系統(tǒng)，并呈劑量依賴(lài)性地促進(jìn)IL-6表達(dá)［12］。有實(shí)驗(yàn)表明，Ang Ⅱ通過(guò)核因子kB、cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白和組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶P300和SRC-1介導(dǎo)的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶依賴(lài)的組蛋白乙酰化作用促進(jìn)IL-6mRNA表達(dá)［13］。Ruwen Cui等［14］首先提出Ang Ⅱ可通過(guò)Rho-phospho-Ser536RelA途徑調(diào)節(jié)VSMCs IL-6表達(dá)。Ang Ⅱ也可促進(jìn)VSMCs表面IL-18Ra表達(dá)，從而強(qiáng)化IL-18誘導(dǎo)炎癥基因的表達(dá)，Ang Ⅱ與IL-18之間信號(hào)通路的交互作用可增強(qiáng)VSMCs炎癥基因的表達(dá)，使AS進(jìn)一步惡化［15］。Ang Ⅱ刺激炎性細(xì)胞產(chǎn)生分泌細(xì)胞因子，它們共同刺激肝細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生和分泌CRP，CRP也可反作用于AngⅡ，影響AngⅡ的作用。Wang等［16］研究發(fā)現(xiàn)CRP可以上調(diào)VSMCs表面AT1R的表達(dá)，從而協(xié)同AngⅡ的生物學(xué)效應(yīng)。AngⅡ促進(jìn)VSMCs表達(dá)與分泌炎癥介質(zhì)的作用伴隨著AS的發(fā)生與發(fā)展。
2．3 AngⅡ?qū)SMCs生長(zhǎng)因子及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá)與分泌的作用 AS中，AngⅡ可促進(jìn)VSMCs表達(dá)及分泌多種生長(zhǎng)因子，如TGF-β1、血小板源性生長(zhǎng)因子（PDGF）、胰島素樣生長(zhǎng)因子1（IGF-1）、表皮生長(zhǎng)因子（HB-EGF）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（bFGF）、epiregulin、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（CTGF）等。TGF- β1 對(duì)VSMCs具有生長(zhǎng)抑制或誘導(dǎo)其增生的雙向調(diào)節(jié)作用，低濃度起促進(jìn)作用，高濃度起抑制作用；而其他由VSMCs分泌的生長(zhǎng)因子有協(xié)同AngⅡ促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。有研究表明PDGF可通過(guò)促進(jìn)NOR1表達(dá)介導(dǎo)平滑肌細(xì)胞的增殖［17］，而且PDGF可促進(jìn)VSMCs表達(dá)與分泌bFGF和激活成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子1型受體(FGFR-1)，通過(guò)FGFR-1對(duì)ERK的持久激活，達(dá)到促進(jìn)細(xì)胞增殖的目的［18］。AngⅡ具有促進(jìn)VSMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化的重要作用。當(dāng)VSMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化后，其可表達(dá)及分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)，纖維連接蛋白、膠原及彈力蛋白等合成增加，這些細(xì)胞外微環(huán)境的改變將更有利于細(xì)胞的遷移及增殖。同時(shí)VSMCs分泌的部分生長(zhǎng)因子，也有促進(jìn)胞外基質(zhì)合成與聚集的作用。 例如TGF-β1就具有調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）蛋白，增加纖連蛋白(FN)、蛋白聚糖和膠原蛋白合成，阻滯基質(zhì)蛋白降解的作用［19］。因而TGF-β1在調(diào)節(jié)AS斑塊的穩(wěn)定性方面起著舉足輕重的作用。另外有研究表明，AngⅡ也可通過(guò)p38MAPK依賴(lài)途徑而非TGF-β1依賴(lài)機(jī)制激活Smad路徑，刺激VSMCs合成細(xì)胞外基質(zhì)［20］。
2．4 AngⅡ?qū)SMCs凋亡的作用 AngⅡ的AT1R和AT2R兩型受體均有介導(dǎo)VSMCs凋亡的作用。Hong Song等［21］通過(guò)TUNEL染色發(fā)現(xiàn)AngⅡ作用的VSMCs組比對(duì)照組細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯增加，AngⅡ加AT1R抑制劑氯沙坦組比AngⅡ組細(xì)胞凋亡指數(shù)增加，而AngⅡ加AT2R抑制劑PD-123319組比AngⅡ組細(xì)胞凋亡指數(shù)減少，但與對(duì)照組比較增加，AngⅡ加兩型受體抑制劑氯沙坦和PD-123319組細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯比前幾組低，此結(jié)果表明，AngⅡ?qū)T1R和AT2R激活均有介導(dǎo)VSMCs凋亡的作用，而AT2R介導(dǎo)VSMCs凋亡的作用更明顯。而Q.N.Diep等［8］通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)AngⅡ通過(guò)AT1R介導(dǎo)的增殖比凋亡作用更顯著。AngⅡ可促進(jìn)VSMCs表達(dá)TGF-β1，而TGF-β1可通過(guò)ALK/smads途徑調(diào)節(jié)VSMCs的凋亡［22］。那么AngⅡ是否有依賴(lài)于TGF-β1的信號(hào)途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡呢？已有證據(jù)表明AngⅡ通過(guò)TGF-β1依賴(lài)途徑促進(jìn)腎小管細(xì)胞凋亡［23］。Santiago等［24］用TGF-β1抗體或ALK抑制劑作用于培養(yǎng)的VSMCs，結(jié)果并不能抑制AngⅡ誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用，并進(jìn)一步證實(shí)AngⅡ通過(guò)AT1R激活p38MAPK途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，不依賴(lài)于TGF-β1/ ALK/ smads 路徑。
Emilio Ruiz等［25］證實(shí)細(xì)胞內(nèi)攝的AngⅡ?qū)SMCs凋亡也具有重要作用。近期有研究表明， AngⅡ所致的VSMCs凋亡與AKT磷酸化抑制和胞膜fasL表達(dá)增加有關(guān)［26］?？赡芤?yàn)檫@兩種信號(hào)傳導(dǎo)路徑與AngⅡ細(xì)胞內(nèi)攝有關(guān)，而內(nèi)攝的AngⅡ可致最終的胞核內(nèi)DNA裂解。AngⅡ的細(xì)胞內(nèi)攝是通過(guò)AT1R介導(dǎo)的，β-抑制蛋白通過(guò)AT1R胞質(zhì)網(wǎng)格結(jié)合蛋白與受體連接介導(dǎo)AT1R- AngⅡ復(fù)合體內(nèi)攝，參與 AngⅡ的部分內(nèi)攝作用［27］。
總而言之，AngⅡ有調(diào)節(jié)VSMCs增殖與凋亡的作用，但在VSMCs表面主要表達(dá)AT1R，AT2R只有少量表達(dá)，因而AngⅡ誘導(dǎo)細(xì)胞增殖比凋亡的作用顯著，最終的結(jié)果是誘導(dǎo)VSMCs增殖，血管壁逐漸增厚，致管腔狹窄。
3 展望
綜上所述，AngⅡ可通過(guò)VSMCs表面受體介導(dǎo)，激活細(xì)胞內(nèi)復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)，促進(jìn)細(xì)胞遷移、增殖、凋亡及表型轉(zhuǎn)化，并有促進(jìn)細(xì)胞表達(dá)及分泌多種生長(zhǎng)因子、炎性細(xì)胞因子及細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的作用，促進(jìn)AS斑塊的形成。當(dāng)然，AngⅡ?qū)⑴cAS的多種細(xì)胞都有刺激作用，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生病理生理變化，促進(jìn)病變的發(fā)生與發(fā)展。雖然對(duì)AngⅡ與AS關(guān)系的研究越來(lái)越深入，但仍有很多問(wèn)題尚待解決：（1）目前研究AngⅡ的作用主要集中在其與AT1R和AT2R上，而其與AT3R和 AT4R的作用尚未明確；（2）AngⅡ在體內(nèi)可分解成AngⅢ和AngⅣ等一系列的代謝產(chǎn)物，它們與受體的作用及機(jī)制有待進(jìn)一步明確；（3）局部的AngⅡ?qū)S的病理生理作用已有很多相關(guān)研究，但循環(huán)的AngⅡ在AS發(fā)生與發(fā)展中的作用及機(jī)制有待探討；（4）AngⅡ?qū)⑴cAS多種細(xì)胞的作用及分子機(jī)制有待進(jìn)一步完善；（5）AngⅡ與TGF-β1、IL及ox-LDL等一些參與AS病理過(guò)程因子間的交互對(duì)話(huà)作用有待進(jìn)一步明確。深入了解AngⅡ?qū)S的病理生理作用及其分子機(jī)制，對(duì)進(jìn)一步研究AS形成過(guò)程具有重要意義，并為臨床抗AS用藥提供科學(xué)依據(jù)，將為臨床AS的有效治療提供新思路。
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摘 要：目的：觀察丹參對(duì)高膽固醇血癥患者內(nèi)皮祖細(xì)胞(endotlial progeIlitor cells，EPCs)的保護(hù)作用。方法：年齡性別匹配的健康志愿者及高膽固醇血癥患者各6例入選研究，各取空腹外周血20mL，采用密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，貼壁選擇法行EPcs培養(yǎng)，以健康志愿者為對(duì)照組，各高膽固醇血癥患者血樣一分為二，分別為高膽固醇組及丹參組，丹參組培養(yǎng)時(shí)另添加復(fù)方丹參注射液10μg/mL，采用流式細(xì)胞術(shù)、倒置顯微鏡、MIT法、Boyden小室等分別觀察各組EPC8數(shù)量、集落形成能力、增殖能力、黏附能力及遷移能力。結(jié)果：高膽固醇血癥患者外周血EPCs數(shù)量較對(duì)照組顯著下降[(6.13±0.84)vs(24.53±3.67)，P＜0.01]，且其克隆形成能力、增殖能力、黏附能力及遷移能力也顯著降低，培養(yǎng)時(shí)添加復(fù)方丹參注射液使丹參組克隆形成能力、增殖能力、黏附能力及遷移能力較高膽固醇組顯著提高，但低于對(duì)照組，其中黏附能力及遷移能力雖仍較對(duì)照組低。但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。結(jié)論：高膽固醇血癥患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量下降，功能受損，復(fù)方丹參注射液對(duì)高膽固醇血癥患者外周血培養(yǎng)的內(nèi)皮祖細(xì)胞功能有保護(hù)作用。
關(guān)鍵詞：丹參；內(nèi)皮祖細(xì)胞；細(xì)胞培養(yǎng)；高膽固醇血癥
隨著內(nèi)皮祖細(xì)胞(endotllelial progenitor cells，EPCs)的研究逐步深入，EPCs和動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病的關(guān)系引起研究者極大興趣。EPCs促進(jìn)血管新生，參與體內(nèi)血管內(nèi)膜損傷的修復(fù)過(guò)程，在動(dòng)脈粥樣硬化早期預(yù)防中起重要作用。高膽固醇血癥是動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病的重要危險(xiǎn)因素。研究發(fā)現(xiàn)高膽固醇血癥患者外周血EPCs數(shù)量減少，功能受損。因此，尋找有效藥物動(dòng)員高膽固醇血癥患者體內(nèi)EPCs、增加外周血EPCs數(shù)量并改善其功能成為動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病防治的一個(gè)研究新方向。丹參具有保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞，改善內(nèi)皮功能的作用。丹參對(duì)于與內(nèi)皮細(xì)胞同一譜系的EPCs是否有保護(hù)作用呢?本實(shí)驗(yàn)觀察高膽固醇血癥患者外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞的變化及丹參的作用，以進(jìn)一步明確丹參的作用機(jī)制。
1 材料
纖維連接蛋白購(gòu)自Boche公司，VEGF購(gòu)自PeproTechEC公司，Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化試劑盒購(gòu)自武漢博士德生物工程公司，MTr購(gòu)自華美生物工程公司PE-CD34購(gòu)自CALTAG LABORATORIES，F(xiàn)ITC-VE-Cadherin購(gòu)自Bender systemTM公司，PE-VEGFR-2及FITC-ACl33購(gòu)自R&D systems，胎牛血清、胰酶、M199、ECGS、Hank's液、PBS均購(gòu)自GIBCO公司，DiI-ac-LDL購(gòu)自Molecularprobe公司，Boyden小室為江蘇海門(mén)麒麟醫(yī)用儀器廠生產(chǎn)，復(fù)方丹參注射液為貴州神奇制藥生產(chǎn)，其余為市售試劑。
2 方法
2．1 實(shí)驗(yàn)分組健康志愿者及高膽固醇血癥患者各6例入選研究，高膽固醇血癥患者的診斷參照1997年中華心血管病學(xué)分會(huì)制訂的《血脂異常防治建議》，兩組年齡、性別匹配。剔除外傷、潰瘍、視網(wǎng)膜病、近期外科手術(shù)、炎癥、腫瘤等影響內(nèi)皮祖細(xì)胞疾病的患者，近3個(gè)月無(wú)急性心肌梗死、心絞痛發(fā)生。各取空腹外周血20mL，采用密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，以健康志愿者為對(duì)照組，各高膽固醇血癥患者血樣一分為二，分別為高膽固醇組及丹參組。
2．2 人外周血EPCs培養(yǎng)，將分離到的單個(gè)核細(xì)胞，以5×106/cm2密度接種于包被有纖維連接蛋白的24孔培養(yǎng)皿中，每組每份血樣各6mm，每皿加入lmL包含有20％胎牛血清、青霉素(100U/mL)及鏈霉素(100U/mL)的M199，丹參組每皿添加復(fù)方丹參注射液101μg/mL，其余各組添加等量培養(yǎng)液，置37℃、5％CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3天后，洗去未貼壁細(xì)胞，如前添加培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)待用。
2．3 EPCs鑒定培養(yǎng)細(xì)胞以0.25％胰酶消化后，制成1×106/mL的單個(gè)細(xì)胞懸液，加入熒光標(biāo)記的CD34、VE-Cadherin、VEGFR-2或ACl33 10μL(1mg/mL)，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞CD34、VE-Cadherin、VEGFR-2及ACl33的表達(dá)。為驗(yàn)證培養(yǎng)細(xì)胞吞噬DiI-ac-LDL，將DiI-ac-LDL以2.4μg/mL的終劑量加入培養(yǎng)液，與細(xì)胞避光共孵育4h，洗去培養(yǎng)液后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光。以不加DiI-ac-LDL的同批培養(yǎng)細(xì)胞作空白對(duì)照。陰性對(duì)照采用GSC7901(胃癌細(xì)胞株)。培養(yǎng)細(xì)胞Ⅷ因子相關(guān)抗原的檢測(cè)采用免疫組化法，空白對(duì)照不加一抗，陰性對(duì)照采用GSC7901。
2．4 外周血EPCs數(shù)量檢測(cè)采用本實(shí)驗(yàn)室方法，取各組分離的外周血單個(gè)核細(xì)胞各1/10，制成1×106/mL的單個(gè)細(xì)胞懸液，加入熒光標(biāo)記的CD34及ACl33各10μL(1mg/mL)，流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞CD弘及ACl33的表達(dá)，以雙陽(yáng)性細(xì)胞為EPCs，QIleBt軟件分析計(jì)數(shù)。
2．5 克隆形成能力檢測(cè)培養(yǎng)第4天，倒置顯微鏡下可觀察到典型細(xì)胞團(tuán)，中間為大量的圓形細(xì)胞，層層疊疊，外周為紡錘形細(xì)胞，向外擴(kuò)散，以大于50個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)為一個(gè)集落，在培養(yǎng)皿上下左右中5個(gè)方位各隨機(jī)取一個(gè)視野(×40)計(jì)數(shù)集落數(shù)，取均值。
2．6 EPCs黏附能力檢測(cè)用0.25％胰蛋白酶消化收集貼壁細(xì)胞，懸浮在500μL培養(yǎng)液中，計(jì)數(shù)，然后將同等數(shù)目的EPCs接種在包被纖維連接蛋白的培養(yǎng)板，在37℃培養(yǎng)30min，洗去未貼壁細(xì)胞，隨機(jī)選取10個(gè)視野(×200)，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)黏附細(xì)胞數(shù)。
2．7 EPCs遷移能力檢測(cè)如上述收集貼壁細(xì)胞并計(jì)數(shù)。將100IIL培養(yǎng)液和VEGF(50ng/mL)加入改良的Boy-den小室的下室，將2×104EPCs懸浮在15μL培養(yǎng)液注入上室，培養(yǎng)24h，刮去濾膜上面的未移動(dòng)細(xì)胞，用甲醇固定，Giemsa染色，隨機(jī)選擇5個(gè)顯微鏡視野(×200)計(jì)數(shù)遷移到低層的細(xì)胞。
2．8 EPCs增殖能力試驗(yàn)如上述收集貼壁細(xì)胞并計(jì)數(shù)。再將等量EPCs接種到包被纖維連接蛋白的96孔培養(yǎng)板，每孔加10μL MTI(5me/mL)，培養(yǎng)4h后，吸棄上清液，再加入二甲基亞砜(150μL/孔)，于微量振蕩器充分振蕩10min，置酶標(biāo)儀測(cè)OD490值。
2．9統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法采用單因素方差分析比較各組均數(shù)，P＜0.05為有顯著性差異。
3 結(jié)果
3．1 EPCs鑒定培養(yǎng)3天洗去不貼壁細(xì)胞及碎片后，可見(jiàn)典型細(xì)胞集落：呈白色半透明，略高于培養(yǎng)平面，中間為大量的圓形細(xì)胞，層層疊疊，外周為紡錘形細(xì)胞，向外擴(kuò)散。6天后流式細(xì)胞儀分析示細(xì)胞表達(dá)CD34，VE-Cadherin，VEGFR-2及ACl33。熒光顯微鏡檢顯示：隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，越來(lái)越多的細(xì)胞吞噬DiI-ac-LDL，顯微鏡下激發(fā)紅色熒光，空白對(duì)照及陰性對(duì)照均無(wú)熒光。培養(yǎng)2周后，Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化陽(yáng)性，胞漿呈棕色，空白對(duì)照及陰性對(duì)照不顯棕色。
3．2高膽固醇血癥患者外周血EPCs數(shù)量的變化與對(duì)照組相比，高膽固醇組外周血EPCs數(shù)量顯著下降[(24.53±3.67) vs (6.14±0.84)，P＜0.01]。
3．3高膽固醇血癥患者外周血EPCs功能的變化及丹參的影響見(jiàn)表1，與對(duì)照組相比，高膽固醇組外周血EPCs集落形成能力、增殖能力、黏附能力及遷移能力均顯著下降(均P＜0.01)；培養(yǎng)液中添加復(fù)方丹參注射液10μg/mL，使丹參組EPCs集落形成能力、增殖能力、黏附能力及遷移能力較高膽固醇組均顯著提高，其中黏附細(xì)胞數(shù)及遷移細(xì)胞數(shù)雖仍較對(duì)照組低[分別為：(14.79±1.93)vs(20.61±8.41)及(19.41±1.90) vs (22.27±7.98)，均
P＞0.05，但 無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
4 討論
眾所周知，高膽固醇血癥是動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病的重要危險(xiǎn)因素：ox-LDL通過(guò)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的氧化損傷、誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡等機(jī)制引起內(nèi)皮功能障礙，從而啟動(dòng)動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程。最近的資料表明，高膽固醇血癥不僅造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷，同樣影響內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量和功能。2003年，Hill等在研究中觀察了45例具有心血管危險(xiǎn)因素但沒(méi)有患心血管疾病的患者外周血EPCs數(shù)量變化，發(fā)現(xiàn)血膽固醇水平與EPCs數(shù)量呈負(fù)相關(guān)。隨后，朱軍慧等發(fā)現(xiàn)，高膽固醇血癥患者不僅外周血EPCs數(shù)量明顯減少，EPCs數(shù)量與血總膽固醇水平和低密度脂蛋白膽固醇水平呈反向線(xiàn)性關(guān)系，而且Ⅱ，cs的黏附能力、遷移能力、增殖能力也明顯受損。進(jìn)一步的研究顯示ox-LDL是高膽固醇血癥患者內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量功能改變的主要原因。本研究結(jié)果顯示高膽固醇血癥患者內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量下降，功能受損，與國(guó)內(nèi)外研究相似。高膽固醇血癥(ox-LDL)導(dǎo)致EPCs數(shù)量減少和功能受損的確切機(jī)制尚不明確，目前認(rèn)為可能與下列因素有關(guān)：(1)ox-LDL直接引起EPCs損傷；(2)ox-LDL增加EPC的凋亡；(3)ox-LDL影響EPCs的分化和動(dòng)員。
內(nèi)皮祖細(xì)胞是指出生后機(jī)體中存在的能特異性歸巢于血管損傷、血管新生部位并分化成內(nèi)皮細(xì)胞的一群干/祖細(xì)胞，參與體內(nèi)血管內(nèi)膜損傷的修復(fù)過(guò)程，在動(dòng)脈粥樣硬化早期預(yù)防中起重要作用。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)冠心病病人循環(huán)中EPCs數(shù)量下降了近50％，遷移能力受損。因此，通過(guò)各種手段動(dòng)員高膽固醇血癥患者的EPCs，提高其外周血EPC8數(shù)量，保護(hù)高膽固醇血癥患者的EPC8，恢復(fù)其功能，將大大降低高膽固醇血癥患者動(dòng)脈粥樣硬化、冠心病的風(fēng)險(xiǎn)。
1 資料與方法
1.1 一般資料 選擇2009年1月至2011年12月在我院血液凈化室89例長(zhǎng)期維持 血液透析患者，男52例，女37例，年均21～79歲，平均年齡 53歲，原發(fā)性為慢性腎小球腎炎，高血壓腎損害，糖尿病腎病，藥物性腎損害，多囊腎等。
1.2 方法 常規(guī)血液透析結(jié)束后，拔去內(nèi)瘺穿刺針，用無(wú)菌壓迫條(由紗布折疊成的1.5×3×1 cm3大小的硬條)壓迫穿刺針眼，松緊適當(dāng)，30 min后逐漸放松，觀察有無(wú)出血及血管損傷情況，每次于透析結(jié)束24 h后將新鮮生土豆切成比瘀血硬結(jié)范圍寬1～2 cm,厚約0.5～1 cm大小的片狀，用膠布或繃帶固定土豆片，使土豆片緊貼皮膚，每3～4 h更換土豆片一次，每日3～4次，視治療范圍大小、所治療時(shí)間不等。
1.3 穿刺血管及周?chē)兓中蜆?biāo)準(zhǔn) 透析結(jié)束穿刺針眼止血結(jié)束后，認(rèn)真觀察穿刺血管硬化及周?chē)步Y(jié)情況。①無(wú)痛型：穿刺血管彈性好，無(wú)疼痛，無(wú)紅腫，無(wú)硬結(jié)。②輕型：穿刺血管較硬，彈性降低，但無(wú)硬結(jié)。③中型：穿刺血管周?chē)霈F(xiàn)硬結(jié)，直徑小于1 cm,有壓痛。④重型：穿刺部位周?chē)步Y(jié)直徑大于1 cm，觸痛明顯。一般于實(shí)施護(hù)理措施3～7 d后觀察判定結(jié)果。
1.4 觀察療效標(biāo)準(zhǔn) 痊愈：穿刺血管局部疼痛完全消失，周?chē)步Y(jié)完全消失，血管彈性恢復(fù)；有效：穿刺部位疼痛明顯緩解，血管變軟，周?chē)步Y(jié)開(kāi)始變軟或明顯縮??；無(wú)效：癥狀如初，不見(jiàn)好轉(zhuǎn)。
2 結(jié)果
顯效81例，顯效率91%，有效8例，有效率9%，總有效率100%。
3 討論
維持性血液透析患者需要一條方便、耐用的血管通路，只有理想的血管通路才能保證有效的血液透析。臨床上患者必須使用16 g穿刺針才能保證充分的血流量，由于長(zhǎng)期反復(fù)的穿刺，對(duì)血管的破壞性極大，使用與保護(hù)不當(dāng)會(huì)造成很多的并發(fā)性，影響動(dòng)靜脈內(nèi)瘺的使用壽命。
土豆又名馬鈴薯、山藥蛋等，主要成分為B族維生素、維生素C、胡蘿卜素及茄定、茄堿、塊莖葛蘇等［2］。土豆中還含有龍葵堿，具有殺菌止癢，消炎消腫止痛等作用。因此在抑制炎癥的過(guò)程中，可使毛細(xì)血管通透性增加，促進(jìn)血液循環(huán)及皮膚新陳代謝。臨床報(bào)道土豆治療肌內(nèi)注射引起的硬結(jié)、靜脈輸注各種藥物引起的靜脈炎癥等均取得良好效果。
我院地處中原地區(qū)，經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)，許多血液透析患者家處山區(qū)、農(nóng)村，雖有新型農(nóng)村合作醫(yī)療保險(xiǎn)，但血液透析費(fèi)用較高，再加上多年的求醫(yī)問(wèn)藥，對(duì)每一位因家庭困難透析不充分，綜合治療跟不上的患者而言，經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)恐怕是最根本的原因。土豆在我國(guó)種植面積較廣，且價(jià)格低廉，透析患者使用土豆片治療血管硬化及周?chē)步Y(jié)對(duì)皮膚無(wú)刺激，安全有效，且取材方便，操作簡(jiǎn)單，無(wú)毒副作用，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，患者更容易接受，值得臨床借鑒推廣。
參 考 文 獻(xiàn)
【關(guān)鍵詞】亞洲帶絳蟲(chóng);膜聯(lián)蛋白b2;基因克隆;免疫反應(yīng)性
abstract: objectiveto clone and express the gene named as annexins b2 of taenia saginata asitica so as to analyze the immunogenicity of its recombinant protein.methodsby online analysis of the gene at bioinfomatics websites to identify the gene from the taenia saginata asiatica full-length cdna plasmid library, the gene was cloned into prokaryotic expression vector pet-28a(+) and then transformed to e.coli bl21 with iptg induction. thereafter, the gene product was analyzed by sds-page and purified by ni-nta affinity chromatography. in addition, the immunoreactivity of the purified recombinant proteins was analyzed by western blotting.resultsas demonstrated by pcr, double enzyme digestion and dna sequencing indicated that the recombinant plasmid was successfully constructed and highly expressed. the recombinant protein tested with western blotting analysis could react with taenia asiatica and taeniarhynchus saginatus infected patient serum.conclusionthe annexins b2 of taenia saginata asitica has been cloned and expressed in the prokaryotic expression system and the purified protein has been confirmed with immunogenicity.
key words: taenia saginata asiatica; annexins b2; gene cloning; immunoreactivity
鑒于亞洲帶絳蟲(chóng)與豬帶絳蟲(chóng)及牛帶絳蟲(chóng)在起源、分類(lèi)學(xué)地位存在的差異[1-2]，本課題組率先構(gòu)建亞洲帶絳蟲(chóng)成蟲(chóng)全長(zhǎng)cdna質(zhì)粒文庫(kù)，并對(duì)該蟲(chóng)進(jìn)行功能基因組的研究工作[3]。本文利用生物信息學(xué)工具從文庫(kù)中篩選到了一個(gè)膜聯(lián)蛋白b2(annexins b2)的同源基因，構(gòu)建了原核表達(dá)載體，并對(duì)其原核表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行免疫學(xué)方面的初步研究。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1血清、載體與菌株3種人體帶絳蟲(chóng)患者血清取自糞檢陽(yáng)性的帶絳蟲(chóng)患者。原核表達(dá)質(zhì)粒pet-28a(+)及大腸埃希菌bl-21/de3由中山大學(xué)熱帶病防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。
1.1.2主要試劑和工具酶ex taq酶(含dntp)，bamhⅰ，xhoⅰ，t4 dna連接酶 (大連寶生物工程公司);異丙硫代-β-d半乳糖苷(iptg)(美國(guó)promega公司);質(zhì)粒純化試劑盒(廣州東盛科技公司);辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗豬igg二抗、兔抗人二抗、3，3二氨基聯(lián)苯胺(dab)顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);氯化鈣、氯化鈉等為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>
1.2方法
1.2.1annexins b2基因的識(shí)別及擴(kuò)增將獲得的亞洲帶絳蟲(chóng)annexins b2基因進(jìn)行blastx分析。并根據(jù)已獲得的該基因全長(zhǎng)編碼序列的開(kāi)放閱讀框，利用軟件設(shè)計(jì)引物(引物由上海聯(lián)合基因公司合成)，分別帶上bamhⅰ和xhoⅰ的酶切位點(diǎn)進(jìn)行pcr反應(yīng)。
1.2.2重組原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定pcr產(chǎn)物和pet-28a(+)載體分別用bamhⅰ和xhoⅰ雙酶切，回收、連接后轉(zhuǎn)入大腸埃希菌bl-21/de3感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)陽(yáng)性克隆依次進(jìn)行質(zhì)粒的提取、雙酶切和pcr鑒定，并進(jìn)行重組質(zhì)粒dna測(cè)序鑒定(測(cè)序由英俊科技股份有限公司完成)。
1.2.3重組蛋白的表達(dá)及純化按照常規(guī)方法進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，考馬斯亮蘭蛋白染色液染色觀察蛋白表達(dá)情況。確定蛋白表達(dá)后，進(jìn)行大量的誘導(dǎo)表達(dá)，并判斷重組蛋白的可溶性，再將樣品加入預(yù)先處理好的ni-ida his.bind樹(shù)脂親和層析純化柱中，最后再用pbs 24h透析以去掉過(guò)柱時(shí)留下的咪唑。
1.2.4western blotting分析重組蛋白的免疫反應(yīng)性用3種人體帶絳蟲(chóng)患者及正常人血清與辣根過(guò)氧化物酶(hrp)標(biāo)記的兔抗人igg進(jìn)行western blotting鑒定。
2結(jié)果
2.1annexins b2基因的識(shí)別和序列分析該基因全長(zhǎng)922bp，編碼區(qū)為224～686bp。其最大orf為其完整編碼區(qū)。
2.2原核重組質(zhì)粒的鑒定將重組質(zhì)粒進(jìn)行pcr和雙酶切鑒定，產(chǎn)物行0.8g/l瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示在500bp左右有一清晰條帶，與目的基因大小基本相符。此外，重組質(zhì)粒的測(cè)序報(bào)告表明插入序列與理論序列一致，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖1)。
2.2蛋白表達(dá)及純化結(jié)果將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到e.coli bl/de3中，超聲裂解后sds-page電泳分析結(jié)果顯示在大約25ku處出現(xiàn)高效表達(dá)條帶(圖2)，與目的蛋白基本相符。測(cè)得純化產(chǎn)物的蛋白濃度為0.526g/l。
2.3western blotting鑒定純化蛋白的免疫反應(yīng)性
用感染亞洲帶絳蟲(chóng)、豬帶絳蟲(chóng)、感染牛帶絳蟲(chóng)的患者血清以及亞洲帶絳蟲(chóng)感染豬的血清與純化蛋白反應(yīng)的結(jié)果均顯示出較清晰的條帶，而陰性對(duì)照血清在相應(yīng)位置未識(shí)別出該蛋白條帶(圖3)，表明該表達(dá)產(chǎn)物具有良好的免疫反應(yīng)性。圖1重組質(zhì)粒的pcr和雙酶切鑒定
fig.1 the identification of the pet-28a(+)-ta annexins b2 by pcr amplification and digestion with restriction enzymesm1：dna標(biāo)準(zhǔn)(dl2000);1：pcr產(chǎn)物;2：pet-28a(+)質(zhì)粒雙酶切;3：pet-28a(+)-annexins b2重組質(zhì)粒雙酶切;m2：dna標(biāo)準(zhǔn)(dl 15000)。圖2100g/l sds-page分析pet-28a(+)-ta annexins b2在大腸埃希菌中的表達(dá)產(chǎn)物及其純化產(chǎn)物fig.2 100g/l sds-page analysis of the prokaryotic expression product and purified product
m：蛋白marker;1：pet-28a(+)iptg未誘導(dǎo);2：pet-28a(+)iptg誘導(dǎo);3：pet-28a(+)-annexins b2 iptg未誘導(dǎo);4：pet-28a(+)-annexins b2 iptg誘導(dǎo);5：pet-28a(+)-annexins b2上清;6：pet-28a(+)-annexins b2沉淀;7：pet-28a(+)-annexins b2純化蛋白。
3討論
帶絳蟲(chóng)病的流行在我國(guó)西部一直是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題。每年由帶絳蟲(chóng)病造成的健康和畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)損失上百億，嚴(yán)重影響西部欠發(fā)達(dá)地區(qū)的社會(huì)發(fā)展。目前，亞洲帶絳蟲(chóng)病的防治研究的重點(diǎn)集中在診斷和疫苗候選抗原、藥物靶標(biāo)、致病的分子機(jī)制研究。圖3重組蛋白的western blotting 鑒定fig.3 western blotting analysis of the recombinantsm：蛋白marker;1：純化蛋白與亞洲帶絳蟲(chóng)患者血清的反應(yīng)結(jié)果;2：純化蛋白與牛帶絳蟲(chóng)患者血清的反應(yīng)結(jié)果;3：純化蛋白與豬帶患者血清的反應(yīng)結(jié)果;4：純化蛋白與亞洲帶絳蟲(chóng)感染豬血清的反應(yīng)結(jié)果;5：純化蛋白與正常人血清的反應(yīng)結(jié)果。
本實(shí)驗(yàn)通過(guò)生物信息學(xué)方法從已經(jīng)構(gòu)建好的亞洲帶絳蟲(chóng)成蟲(chóng)cdna質(zhì)粒文庫(kù)中篩選出了一個(gè)膜聯(lián)蛋白(annexins b2)的同源基因，并且預(yù)測(cè)出該基因位于胞漿，無(wú)跨膜區(qū)，二級(jí)結(jié)構(gòu)基本上是以α螺旋為主。這些都符合膜聯(lián)蛋白家族的共同特征[4]。根據(jù)膜聯(lián)蛋白家族分布廣泛，表達(dá)豐富且穩(wěn)定的特性，可以推測(cè)其在絳蟲(chóng)的生理活動(dòng)中可能起著重要的作用。
膜聯(lián)蛋白是一個(gè)廣泛存在的蛋白家族，在所有真核基因組中廣泛表達(dá)。具有內(nèi)部重復(fù)單位和“g-x-g-t-(38residues)-d/e”基序[5]，即ca2+結(jié)合區(qū)域的特征，用以結(jié)合帶有負(fù)電的脂質(zhì)。雖然它為鈣結(jié)合蛋白，但是在結(jié)構(gòu)上卻沒(méi)有ef手，而且在和ca2+結(jié)合后，還可以與磷脂再次結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。例如，細(xì)胞的胞吞胞吐，離子通道的形成，調(diào)節(jié)磷脂酶a2的活性及細(xì)胞內(nèi)外ca2+濃度、抗炎癥反應(yīng)等。在長(zhǎng)期的生物進(jìn)化過(guò)程中，膜聯(lián)蛋白家族各成員在生物學(xué)特性和生理功能方面表現(xiàn)出非常復(fù)雜的關(guān)系，且在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，annexins沒(méi)有信號(hào)肽，沒(méi)有跨膜結(jié)構(gòu)，是一個(gè)典型的細(xì)胞內(nèi)蛋白。但是，卻有學(xué)者發(fā)現(xiàn)它可以與細(xì)胞外基質(zhì)發(fā)生作用。例如，抗炎[6]、抗凝[7]、抑制腫瘤[8]等。最新的研究報(bào)道，當(dāng)將其作為疫苗的候選因子時(shí)，可以消除一些寄生于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的寄生蟲(chóng)。此外，學(xué)者們認(rèn)為膜聯(lián)蛋白是維持細(xì)胞膜表面結(jié)構(gòu)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能的重要蛋白。并可能具有激活纖維蛋白酶原的功能，有助于破壞宿主的結(jié)締組織，使蟲(chóng)體抗原更加容易進(jìn)入宿主機(jī)體，誘發(fā)免疫應(yīng)答。因此，對(duì)該基因的研究有助于進(jìn)一步了解它的生物學(xué)功能及開(kāi)辟預(yù)防治療寄生蟲(chóng)病的新途徑[9-10]。
目前，annexins b2已經(jīng)在豬囊尾蚴的研究被發(fā)現(xiàn)并命名，但是具體的生理功能還不清楚，且在亞洲帶絳蟲(chóng)研究領(lǐng)域還是空白。因此，本研究將亞洲帶絳蟲(chóng)成蟲(chóng)annexins克隆到原核表達(dá)質(zhì)粒pet-28a(+)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒，在大腸埃希菌bl-21/de3中用iptg誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物通過(guò)sds-page電泳進(jìn)行鑒定。sds-page結(jié)果表明，該蛋白在全菌和沉淀中都有表達(dá)，上清中有微量的表達(dá)，說(shuō)明annexins主要表達(dá)在包涵體中。因此，進(jìn)一步溶解包涵體[11]，經(jīng)變性處理并親和層析純化后，得到了大量較純的重組蛋白。此外，還嘗試性的用上清過(guò)柱純化并用蔗糖進(jìn)行蛋白濃縮，也得到部分有活性的蛋白。western blotting就是以抗體-抗原沉淀反應(yīng)為基礎(chǔ)的，可用于不同抗原的比較和定量。其檢測(cè)結(jié)果表明所獲得的重組蛋白與豬帶絳蟲(chóng)、牛帶絳蟲(chóng)及亞洲帶絳蟲(chóng)有較強(qiáng)的交叉反應(yīng)且在絳蟲(chóng)中的診斷特異性不高，推測(cè)其不能作為免疫診斷抗原的合適候選分子。但是，其具有免疫活性的高效表達(dá)。由此可推測(cè)它是一個(gè)具有開(kāi)發(fā)潛力的基因?？傊?，本項(xiàng)研究填補(bǔ)了該蛋白在亞洲帶絳蟲(chóng)研究領(lǐng)域的空白，也為進(jìn)一步研究該基因的生物學(xué)功能及在診斷尤其是疫苗研究方面奠定了基礎(chǔ)。
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